A baktérium  prokariota, nincs sejtmag, haploid, általában egy, kör alakú kromoszóma + plazmidok,

• információ átvitel, rekombináció : konjugáció, transzdukció, transzformáció segítségével

• rekombináció a lítikus ciklusban kevert fertőzés esetén

prototróf - "vad típusú" baktérium, minimál táptalajon nő,  C, N forrás, sók, víz. A minimális tápigény fajonként eltérő lehet (nitrogénkötés, fotoszintézis, aerob, anaerob ...)

auxotróf - mutáns baktérium,  melynek külön tápigénye van a vad típushoz képest. Például nem tud egy aminosavat, bázist, vitamint szintetizálni, cukorhasznosítás ...

rezisztencia markerek

• szűkebb értelemben antibiotikum rezisztencia (pl. sterptomycin rezisztencia), mely oka : mutáció vagy extra gén (antibiotikum hatástalanításra) megjelenése is lehet
•  tágabb értelemben környezeti tényezőkkel szembeni tolerancia: ozmotikus, pH, nehézfém, UV, hő, detergensek, bakteriofág ...

egyéb markerek - motilitás, telepmorfológia, szín (pl. enzimaktivitás kimutatás)

10-1   Baktériumok vizsgálata A baktérium szuszpenzióból a megfelelően higított kultúrát egy szilárd táptalaj felületére szélesztjük. Egy szabad szemmel nem látható baktériumból 1-2 nap múlva sok millió sejtet tartalmazó telep (kolónia) fejlődik. Ahány baktérium volt eredetileg, annyi telep keletkezik, ha  a táptalaj nem "szelektív".  Szelektív táptalaj esetén csak azok a sejtek tudnak osztódni és telepet képezni, melyek tartalmazzák a megfelelő, szelektált allélokat (pl rezisztencia marker, cukor hasznosítás, vad típusú bioszintézis gén). A megfelelő a szelektív táptalaj alkalmazásával akár 1000 millió baktérium közül is ki tudjuk választani (felnöveszteni) a számunkra érdekeset.

szelektálható markerek - a vad vagy a mutáns allél előnyt vagy hátrányt jelent a baktériumnak,  így  megfelelő szelekciós körülményeket  biztosítva ki lehet válogatni az egyik allélt tartalmazó baktériumokat (csak azok képesek növekedni és telepet képezni - permisszív és restriktív körülmények)

látható markerek - a vad vagy mutáns allélt hordozó egyed növekedésében nincs kölönbség, de az eltérő genotípusú baktérium kimutatható a többi között (pl. festés) Szelekció és screen (átvizsgálás)

gének nevezéktana : a baktériumgenetikában a gének elnevezésénél elterjedt a hárombetüs rövidítés (+ 1 pl. recA, trpR ). A jelöléseknél dőlt betűt használunk. (Szemben a gén által kódolt fehérje megnevezésével. amit nagy kezdőbetüvel és nem dőlt betüvel szokás írni, például recA gén és RecA fehérje.)
 

Egyszerüsítés a mutánsok jelölésénél:
sok esetben egy baktérium genotípusának felsorolásánál a metB ^-  =  metB

Pl.  az E. coli HB101 törzs genotípusa :

thi-1, hsdS₂₀, supE₄₄, recA ₁₃, ara-14, leuB₆, proA₂, lacY₁ , rpsL₂₀, xyl-5, mtl-1

thi, hsdS, supE, recA, ara, leuB, proA, lacY, rpsL, xyl, mtl

Többszörösen auxotróf törzseket kevertek össze :

Összekeverés után, minimál táptalajon kis gyakorisággal (10 ^-7) telepek jelentek meg. Ezekről feltételezték, hogy prototróf rekombinánsok utódai. A kontroll kísérletekben — ahol a két törzset külön-külön szélesztették a minimál táptalajra — telep sohasem jelent meg. Igy biztosak lehettek abban, hogy nem a mutációk reverziójáról van szó. Ennek több marker esetében nagyon kicsi a valószínűsége.

10-4:  Lederberg és Tatum kísérlete Külön egyik mutáns törzsből sem keletkeznek prototróf egyedek, csak az összekeverésük után. Genetikai információátadás történik és utána rekombináció. (MM = minimal medium)

Később bizonyították (U-cső kísérlet,  Bernard Hayes, 10-1. ábra), hogy  fizikai érintkezés kell a rekombinánsok megjelenéséhez.
Kérdés volt, hogy vannak-e kapcsoltsági csoportok és hogyan lehet térképezni őket.
A kezdeti kísérletek eredményeit nem lehetett értelmezni, mert nem tudták, hogy a rekombinánsok mely szülő utódai.  

10-5: Az U-cső kísérlet .  A középső szűrő nem engedi meg a két baktériumtörzs keveredését, de a tápfolyadék szabadon áramolhat. Ilyen elrendezésben nem lehetett rekombinánsokat (prototróf telepek) kimutatni. Ebből következően fizikai érintkezés szükséges az A törzs és a B törzs között, hogy rekombináns utódok jöjjenek létre.

A fertilitási (F) faktor felfedezése

Mi az A törzs és a B törzs (szülők) szerepe a keresztezésben? Hogyan keletkeznek a rekombinánsok?

William Hayes (1953) kísérleteket végzett az transzfer (információátvitel) irányának megállapítására. Az egyik szülő elölésére streptomycin antibiotikumot alkalmazott. A streptomicinre érzékeny törzsek fehérjeszintézisét gátolja az antibiotikum. Ha megfelelő ideig jelen van, akkor a sejt már nem képes szaporodni, de egy ideig vegetál és a keresztezésben "aktív". (! Egyik törzs sem Str^R ! a keresztezésben ! )
 

Csak a B törzs elölése akadályozza meg a rekombinánsok keleltkezését. Tehát a transzfer nem nem kétirányú !
"Szexuális" kölönbség van a törzsek között : A = donor törzs ("male"),  B = recipiens törzs ("female").

Később kiderült, hogy lehet "steril" (donor tulajdonságát elveszített) A törzset izolálni, tehát a fertilitási tulajdonság (viszonylag nagy gyakorisággal) elveszhet, függetlenül más markerektől.

Újabb keresztezési kísérletekben azt is bizonyították, hogy a fertilitási tulajdonság — függetlenül más markerektől — nagy gyakorisággal átjut a donor sejtből a recipiensbe. A kísérlet elvégzéséhez streptomicin rezisztens ( strR ) törzset izoláltak a steril A törzsbôl, mely a recípiens partner volt a keresztezésekben.

A keresztezés után az eredetileg steril, de str ^R  törzs minden harmadik egyedéből fertilis (donorként viselkedő) törzs lett. Tehát van egy fertilitási (F) faktor,  mely sokkal gyakrabban jut át a donorból a recipiensbe, mint az egyéb markerek. A donor törzs ezt tartalmazza ( F ⁺), míg a recipiens törzsben ez a faktor nincs jelen, ezért azt F ^- törzsnek hívjuk. 

Szelekciós vagy szelektálható marker az a marker (tulajdonság, gén) melynek  jelenlétében az azt tartalmazó baktériumok szaporodni képesek a szelekciós körülmények (antibiotikum, aminosav hiány, cukor jelenléte) között. E tulajdonsággal nem rendelkező utódok (szülők) pedig nem képesek szaporodni. Ellenszelekció az, ha legalább az egyik szülő (donor) szaporodását megakadályozom a másik szülőben meglévő szelektálható marker felhasználásával (a fenti és a 10-6 ábra példájánál ez a streptomicin).

10-2 : Az F faktor jellemzői Az F faktort tartalmazó donor törzs pilusokkal rendelkezik. Az F faktor egy kópiája jut át a recipiens sejtbe. Az F faktor a kromoszómától függetlenül replikálódik.

A Hfr törzsek

Luca Cavalli-Sforza egy kísérletében véletlenszerűen ezerszer több rekombináns jelent meg  a szokásosnál. A kísérletben alkalmazott donor törzs megtartotta ezt a tulajdonságát. Ezért elnevezték Hfr törzsnek  ( high frequency of recombination). Ez lett később a HfrC jelű donor. A felfedezést követően nagy számú Hfr törzset izoláltak és ez felgyorsította az E. coli genetikai térképének elkészítését.  

A géntérképezés lehetősége

Elie Wollman és Francois Jacob  (1957) tanulmányozta az F faktor és más genetikai markerek átjutását a Hfr x F^- keresztezéseknél. Bevezették a "megszakított párosodás" (interrupted mating) módszert, ahol a donor és recipiens összekeverését követően meghatározott időnként mintát vettek és erőteljesen megkeverték azt (turmixgép), majd egy részét szelektív táptalajra szélesztették. Ki tudták mutatni, hogy egy adott Hfr törzs esetében a markerek átjutása meghatározott időbeli sorrendben történik.

A 10-6a. ábrán összegzett kísérletben a donor  Hfr azi ^R, ton^R ,  (lac⁺, gal ⁺ str ^S), a recipiens F^-  str ^R, lac^- , gal^-    (azi ^S , ton^S ) volt. A streptomicin "ellenszelekciós" eszköz, mert a konjugáció utáni populációban elöli a donor sejteket. A konjugációban részt vett (exkonjugáns) recipiensekben megjelenő donor markerek jelenlétére (a rekombinánsokra) a megfelelő táptalaj megválasztásával lehetett szelektálni.

Például a MM (minimál) táptalajba szénforrásként laktózt alkalmazva és streptomicint téve csak azok a rekombinánsok nőnek, melyekbe a donorból bejutott a lac+ allél. Az összes donor elpusztul a streptomicin jelenléte miatt és a nem rekombináns recipiensek sem tudnak nőni laktózon.  

10-6a ábra : Perctérképezés.  A markerek átjutási idejének meghatározása a megszakított keresztezés módszerének segítségével.  Lásd a 10-7. ábrát. 10-7 ábra : Perctérkép a 10-6a ábrán bemutatott kísérlet alapján.

A genetikai rendszer kiépítése

A baktériumok párosodási folyamata a konjugáció, melynek során genetikai információ (DNS) jut át a donor baktériumból a recipiensbe. Az átjutó DNS általában csak egy részét képviseli a donor genetikai állományának, és a bejutott kromoszómális gének megmaradásához szükség van rekombinációra is (10-12 ábra).  Az átjutási idő és a rekombináns kategóriák meghatározásával lehetővé vált a baktérium kromoszómáján a gének elhelyezkedésének vizsgálata, azaz genetikai térképezése ( 10-7 ábra).  A "perctérképezés" a megszakított párosodás segítségével lehetővé teszi, hogy egymástól nagyobb távolságra elhelyezkedő, több perc különbséggel átjutó gének sorrendjét meghatározzuk.  

Már kis számú marker (auxotrófiát okozó vagy valamilyen rezisztenciát okozó mutáció) alkalmazásával is meg lehet szerkeszteni egy kezdetleges genetikai térképet, ha azok viszonylag random helyezkednek el a kromoszómán. A genetikai térképezés feltétele a megfelelően nagy "mutánspark" létrehozása és olyan donor és recípiens törzsek konstruálása, melyek az izolált új mutációk térképezését lehetôvé teszik.

Az E. coli mutációk térképezésére különböző Hfr törzseket (donor) izoláltak és ezekkel végeztek perctérképezést. Kiderült, hogy sok esetben a gének átjutási sorrendje nem egyezett meg. Ugyanazokat a mutációkat alkalmazva a különböző Hfr izolátumokkal végzett kísérletekben más és más volt az átjutási sorrend ( 10-8. ábra ). Igy a génsorrendek látszólag eltérnek, de ha feltételezzük, hogy az egyes Hfr törzsekben az F faktor más helyről és irányban indít kromoszóma átvitelt a recipiensbe, akkor minden esetben ugyanaz a kör alakú (cirkuláris) kromoszómatérkép szerkeszthető meg. Újabb és újabb mutációk izolálásával és térképhelyzetének meghatározásával a genetikai térkép egyre pontosabbá tehető.  

10-8. ábra:    Különböző Hfr törzsek segítségével készült perctérképek.

Tehát a kromoszómatranszfer során az F plazmid több helyre is beépülhet, és az integráció irányítottságától függően jutnak át az első kromoszómális markerek az (O, pontosabban oriT ) régió után (10-9. ábra ), mely itt a transzfer origóját jelenti. Utoljára az ún. fertilitási gének jutnak át, ezért — ha a plazmid integrálódott a kromoszómába — ennek az eseménynek nagyon kicsi az esélye. Nagy valószínűséggel előbb megszakad a konjugáció. 

A Hfr törzsek esetében az F plazmid eleve kromoszómába integrálódott formában van jelen. Ezért sokkal nagyobb a kromoszómatranszfer gyakorisága, és ezért nincs általában donor tulajdonság (fertilitási régió) átjutás. 

Az önálló replikonként jelen lévő F plazmidnál a helyzet éppen fordított. A donor tulajdonság nagy gyakorisággal átjut, mert az oriT és fertilitási régiót nem választja el egy teljes kromoszóma. Ez a Luca Cavalli-Sforza által kapott eredmények magyarázata. A 10-10 ábrán két konjugációban résztvevő E. coli sejt látható.  

Az F plazmidról ma már tudjuk, hogy nagyjából 100 kb nagyságú és ezen belül több mint 30 kb hosszan helyezkedik el a transzfert kódoló régió, melynek a pilus képzésben és a konjugációban van szerepe. Itt található az oriT régió és több tucat tra és trb gén is. A pilusok anyagát adó pilin monomereket a traA gén kódolja.

Konjugációkor egyszálú DNS jut át, mely a recipiens sejtben újra dupla szálú lesz és egyes részei kettős vagy páros számú homológ rekombinációval kicserélődhetnek a recipiens kromoszóma megfelelő részével (10-12 ábra). Az átjutási idő mérése (perctérkép) nagy távolságokra lévő markerek térképezését teszi lehetővé és speciálisan az E. coli Hfr törzsek esetében használható.   

10-12 ábra: A konjugációval átjutott markerek beépüléséhez legalább két rekombinációs esemény szükséges. (a) nincs rekombináció (b) egy crossing over van, a termék nem "életképes". (c) két rekombináció esetén az a+ marker kicserélődik az a- markerrel és a+ rekombináns baktérium keletkezik.

    Más baktériumok kromoszómatérképét számos esetben ún. R-faktorokból (rezisztencia faktorok) származó széles gazdaspecifitású konjugatív plazmidok segítségével készítették el. Ezek a plazmidok szintén sok pontról indíthatnak kromoszóma átvitelt, de nem izolálható esetükben Hfr jellegű törzs. A transzfer így magas kromoszóma átviteli frekvencia esetén is véletlenszerű, tehát nem alkalmas perctérképezésre. Ebben az esetben egy vagy több kromoszómális markernek (nem szelektált markerek) egy kiválasztott (szelektált) markerrel való együttes "átjutásának" a gyakoriságát (kapcsoltság) lehet mérni. Minél közelebb van két marker egymáshoz, annál kisebb a valószínűsége közöttük a rekombináció (crossing over) bekövetkezésének, tehát annál nagyobb a szelektált és a nem szelektált marker kapcsoltsága. A "kapcsoltsági" érték fordítottan arányos két marker távolságával, ezért a kapcsoltsági értékek nem adhatók össze.   

Kétpontos térképezés estén két marker egymástól való távolságát mérhetjük meg. Több kétpontos térképezés eredménye alapján meghatározhatjuk több marker egymáshoz viszonyított helyzetét is, ha a kisérletben szereplő markerek nincsenek túl közel egymáshoz.
Például a 10-13. ábrán látható elrendezésben a leu-arg távolság =5, az arg-met távolság =5 és ha egy harmadik kísérletben a leu-met távolság 10-nek adódik, akkor következtethetünk a fenti leu-arg-met sorrendre. 

Hárompontos térképezés esetén egy szelektált és két nem szelektált marker közötti összes lehetséges rekombinációs eseményt együtt tudjuk vizsgálni, egyetlen keresztezésben. Ha a három marker a 10-13. ábrán mutatott sorrendben helyezkedik el, akkor sok leu ⁺arg⁺met⁺ rekombináns fog keletkezni és nagyon kevés vagy semennyi  leu ⁺ arg^- met⁺ variánst találunk (leu ⁺ -ra szelektálunk), hiszen ez utóbbi kategória megjelenéséhez négyszeres crossing overnek kell lejátszódnia. A meg nem jelenő, vagy ritka rekombináns kategória egyben megerősíti a markerek sorrendjét is. Ha a sorrend
leu - met - arg lenne a valóságban, akkor a  leu⁺ arg⁺met^- kategória lenne ritka és több leu⁺arg ^- met ⁺ változat lenne.

INFORMÁCIÓ ÁTVITEL KONJUGÁCIÓN KÍVÜL 

Transzformáció
Csupasz (tisztított) DNS segítségével is átkerülhetnek gének a donor (elölt) sejtekből a recipiensbe.  Klasszikus példa erre Griffith nyomán Avery kísérlete, amelyben elsőként bizonyította, hogy a DNS az örökítő anyag. (Streptococcus S és R törzsek és az egerek). 

Sok baktériumnál ismertek természetes DNS-felvevő  rendszerek, melyek révén hasznos géneket  szerezhetnek be környezetükből. Lásd később.

A  mesterséges transzformáció, elektroporáció kodolgozásának nagyon fontos szerepe volt a  molekuláris klónozás módszerének megteremtésében, az in vitro DNS-pakolás mellett.

Általános transzdukció

10-30. ábra: Az általános transzdukció. Néhány fágrészecske csak baktérium DNS-t tartalmaz. Ha a- sejtekkel hozzuk össze az a+ sejten növesztett fágpopulációt, akkor kimutathatjuk az a+ marker átjutását, transzdukcióját.

    Általános transzdukciósegítségével bármilyen helyzetű gén átvitele lehetséges. Általános transzdukciót végző fág például az E. coli P1 fágja. Ebben az esetben a fágrészecskék érése során a kialakuló fágfejbe, nagyon ritkán és véletlenszerűen, bakteriális DNS kerül (fág DNS nem). A legtöbb fág nem hordoz bakteriális DNS-t. A bakteriális DNS-t hordozó fágrészecske fertőzőképes (azaz képes a benne lévő DNS bejuttatására), de természetesen elszaporítani nem lehet. Olyan mint egy trójai faló, az idegen DNS általa jut be a baktériumsejtbe és rekombináció után a bejuttatott marker (gén) kicserélódhet a baktériumtörzsben lévő eredeti markerrel. Megfelelő szelekciós rendszer esetén a rekombinánsok kimutathatók. Rövid, néhány tucat gént hordozó DNS-szakaszok finomtérképezésére alkalmas. Nagyobb távolságok térképezése a bepakolható DNS limitált hossza miatt nem  lehetséges.

Speciális transzdukció

    A speciális transzdukció esetén a transzdukáló fág csak néhány meghatározott kromoszómális marker átvitelére képes. A jelenséget a lambda fág — E. coli rendszeren fedezték fel és tanulmányozták behatóbban. A lambda fág, mint temperált fág, profágként a baktérium kromoszóma specális helyén (attB) képes integrálódni a genomba. Kiszabadulásakor magával ragadhat néhány gént a környezetéből. Messzebb lévő gének átvitelére nem alkalmas.

Az E. coli klasszikus genetikai térképének utolsó kiadása - mely a szekvenálási erdményeket még nem foglalta magába -  2220 gént és 40 egyéb térképezhető markert tartalmazott. A szekvencia teljes ismeretében jelenleg több mint 4000 gén meglétét feltételezik.

A 10-33. és 10-34. ábrákon az E. coli cirkuláris genetikai térképe illetve annak egy részletesebb szakasza látható.   

10-33. ábra:  Az E. coli kromoszómatérképe (itt 90 perces körön ábrázolva).   10-34. ábra: Az E. coli kromoszómatérkép egy 5 perc távolságnyi részletének markersorrendje.

A DNS-szekvencia meghatározás előtti időkben a legnagyobb felbontást E. coli esetében a P1 fággal végzett kotranszdukciós térképezés (általános transzdukció) szolgáltatta. A 10-32. ábra néhány génből álló szakasz  térképét mutatja be. A szekvenciaadatok alapján például az ábrán látható hemA - narCrégió valójában 17621 bp hosszúságú. A régió szekvenciája és a szekvencián behatárolt géneket a D90757 regisztrációs számú Nukleotid Adatbázis rekord tartalmazza (többek között) A narC az új nevezéktan szerint a bisD nevet viseli, korábban narG-nek is hívták.  

10-32. ábra: Egy P1 kotranszdukcióval készült részletes genetikai térkép. A számok a kotranszdukciós gyakoriságokat jelzik, ezért nem additívak. Molecular and General Genetics 105: 285- (1969)

Az E. coli K12 törzsrôl jelenleg fellelhetô ismeretek az interneten keresztül érhetők el.

A szekvencián alapuló publikált térképtérkép (1998) pedig a http://mmbr.asm.org/cgi/content/full/62/3/814/F1   címen tekinthető meg. Ennek egy részletét mutatja a 10-40 ábra. 

10-40 ábra: A E. coli  szekvenálási adatokat is magába foglaló genetikai térképének  első 16 percnyi részlete a bal oldalra klikkelve kinagyítva megtekinthető

Az interneten lassan a genomokkal kapcsolatos minden fontos információ megtalálható. 
Igy természetesen elérhetjük rajta keresztül a klasszikus munkákból megismert T4 és lambda fág (10-41. ábra) teljes szekvenciáját, genetikai térképét is.

A lambda fág genetikai térképe.

10-41. ábra: (nagyítható)

A T4 fág genetikai térképe.

Genomszekvenálás

A hosszú időt igénylő és fáradságos genetikai munkát napjainkban felváltja (vagy részben megelőzi) a genomszekvenálás. Számos mikroorganizmus genomjának szekvenciáját meghatározták már anélkül, hogy az E. coli hoz hasonló részletes genetikai térkép (és a hozzá tarztozó mutánspark) elkészült volna. Természetesen az ismeretlen  szekvenciák számítógépes kiértékelésekor az E. coli és más élőlények  genetikailag, és szekvencia szinten is ismert génjeivel való azonosságokat vették és veszik alapul. 

A genomprojektek nagy tőkekoncentrációt és informatikai hátteret igényelnek. A szekvencia alapján elkészített géntérképek (már ismert génekkel való hasonlóság alapján feltételezett gének sorrendje a szekvencián) , és a feltételezett gének funkciójának bizonyítására utólagos genetikai munkára (mutánsok izolálása, jellemzése) van szükség. 

 A genetikai munkát nem helyettesíti, csak megelőzi a genomszekvenálás !
Egy gén funkciójának bizonyítására mindig kísérletes, genetikai, molekuláris biológiai munkára van szükség.

Azoknak a mikroorganizmusoknak a listája, amelyeknek teljes szekvenciáját meghatározták vagy a munka folyamatban van, a következő internet címen érhető el: