2005.10.15. 
Mozgó genetikai elemek
- prokarióta - eukariótákban -

Az élesztőben elterjedtek a Ty elemek. A Ty1 elem 5.6 kb hosszú és a végein 300 bp direkt ismétlődés található (delta szekvenciák, 21-25 ábra) . Körülbelül 35 példányban található meg az élesztő genomban. A Ty elemek transzpozíciójakor RNS intermedier keletkezik (lásd később).
 
21-25. ábra:
Az élesztő Ty1 elem szerkezete.


A Drosophila mozgó elemeknek három csoportja is van, melyek felépítését a 21-26 ábra mutatja.  A  Copia-like elemek legalább hét alcsoportra bonthatók. Hosszuk 5 - 8.5 kb körüli és 10 - 100 példányban találhatók meg egy átlagos genomban. Minden típusnak hosszú direkt ismétlődés található a két végén, melyek mindegyike egy rövid fordított ismétlődésben végződik. Ismertebb képviselőjük a gypsy alcsalád.
 
21-26. ábra:
 
Drosophila mobilis elemek:
 
- copia-like
- FB és 
- P elemek

 Az FB  vagy fold back elemek két egymással szemben álló ismétlődésből állnak. A család tagjai között szekvencia hasonlóságok vannak, de méretben nagyon különbözőek. Néhány száz bázispártól néhány ezer bázispárig terjedhet a nagyságuk és az ismétlődések egyedi szekvenciát is közrezárhatnak. Az FB elemek nagy gyakorisággal okozhatnak kromoszóma átrendeződést is.

A P elemek és mesterséges változataik a legjobban használható mobilis elemek a Drosophila genetikában. Ezeket az elemeket a hibrid diszgenezis jelenség tanulmányozása során fedezték fel (21-27. ábra).  


21-27. ábra.
  A hibrid diszgenezis jelensége.


Ha egy laboratóriumi nőstény egyedet kereszteznek egy természetes populációból származó hímmel, akkor az utódok között szembetűnően nagyszámú mutáns található. Tehát a hibrid vagy F1 nemzedék diszgenikus, ami annyit jelent, hogy hibás.

Ennek az a magyarázata, hogy a laboratóriumi törzsben nincs P elem és így a transzpozíciót gátló P-represszor fehérje sem található meg a petesejtben. A megtermékenyítés után a hím kromoszómáin lévő P elemek ezért - a gátló hatás elmaradása miatt - nagy gyakorisággal áthelyeződnek, a legkünönfélébb mutációkat, kromoszóma átrendeződéseket okozva 
(a lambda fág esetében hasonló jelenség a zigótikus indukció).

   

A P elem 30 - 50 példányban lehet jelen a Drosophila genomban, de a laboratóriumi törzsből (M típus) teljesen hiányzik. A P elemek nagysága 500 és 2900 bp között változhat. Jellemző rájuk, hogy egy tökéletes fordított ismétlődés van mindkét vegükön. A teljes P elem által kódolt transzpozáz gén négy exonból áll.

Retrovírus, retrotranszpozon

Sok eukariota transzpozon felépítése és mozgása nagyon hasnlatos a retrovírusokéhoz. Ezeket nevezzük retotranszpozonoknak. A retrovírusok olyan RNS vírusok, melyek genomja a fertőzés után a vírusban található és kódolt reverz transzkriptáz segítségével átíródik DNS molekulává és ez képes beépülni a fertőzött sejt genomjába (21-30. ábra.). 

21-30. ábra: A retrovírusok szaporodási ciklusa.

Az egér emlőtumor vírus (MMTV - mouse mamary tumor virus) vagy a Rous szarkoma vírus (RSV) retrovírusok, melyek tumorok kialakulását is okozhatják. Beépülve a genomba elronthatnak olyan géneket, melyek a sejtosztódást szabályozzák. 



A retrovírus reverz transzkriptáz enzime segítségével az RNS genom kettős szálú DNS fragmentté alakul, mely képes beépülni a célsejt valamelyik kromoszómájába. 
Az integrálódott vírusgenom irányításával sok vírus mRNS (genom) keletkezik, melyekről megtörténik a vírusfehérjék szintézise, majd ezt követően vírus RNS becsomagolása.
A retrovírusok és néhány transzpozon szerkezetét hasonlítja össze a 21-32. ábra.

21-32. ábra: A retrotranszpozonok és retrovírusok felépítése.
Az élesztő Ty elemek és a Drosophila Copia elemek szekvenciája hasonlít a retrovírusok genomjához. Hasonló fehérjéket kódoló gének találhatók mindhárom esetben ( gag, int, env, pol). A Ty elem RNS intermedieren keresztül történő transzpozíciójának bizonyítékát mutatja be a 21-33. ábra.


21-33. ábra: A Ty elem áthelyeződése RNS intermedieren keresztül történik.
 
A Ty elem kódoló régiójába egy idegen génből származó intron szekvenciát helyeztek el és ezt a mesterséges elemet egy galaktóz érzékeny promoter után építették.  A konstrukciót bejuttatták élesztőbe, majd galaktóz segítségével "aktiválták", azaz a promoter "bekapcsolása " révén elősegítették a transzpozíciót.

Az áthelyeződött Ty elemek már nem tartalmazták a mesterséges intron szekvenciát, ami azt jelenti, hogy egy RNS prekurzor segítségével történhetett az áthelyeződés, amiből a splicing (RNS érési) mechanizmus eltávolította az intront.
Ha nincs RNS intermedier, a beépített szakasz stabilan megmaradt volna.



A kukorica és az alapkutatás. 
 (A kukorica kontroll elemei)

1938.-ban Marcus Rhoades a mexikói fekete kukorica (black mexican sweet corn) önmegtermékenyített csövét vizsgálta. A csõ tisztán tenyészõ, színes szülõktõl származott.
    12:3:1 arányban talált

fekete    :    színtelen alapon fekete pettyes   :   sárga szemeket 



21-35. ábra.

Ez egy “dihibrid F2” cső: kiderítette, hogy A1›a1 átalakulás történt (megjegyezzük, hogy az a1 jelölés egyszerűsítés, nem a “klasszikus”, hanem egy speciális a1 allélról van szó) és kell lennie egy “pettyesítő” elemnek is: Dt, domináns dt felett, amivel egyszerűen Dt hiányát jelölhetjük. A Dt hatása: a1a1 háttéren Dt hatására pettyek, ami a1›A1 reverzió, ami túl gyakori eseménynek tűnt a szemek szintjén ennyi esetben, de a portokok szintjén kimutatható volt a reverzió (a1a1 Dt- növény színes portokjából származó virágporral termékenyítve az a1 növényt, színes magvak lettek), a feltevés elfogadottá vált.



21-36. ábra.

Kialakult tehát: a megfigyelt “F2” cső elődje: A1a1 Dtdt genotpusú volt. A (speciális) a1 allél Dt jelenlétében nagy valószínűséggel revertál, ami stabil A1 allélhoz vezet.
Rhoades megtalálta tehát az első mutáns allélt, amely instabil, mert reverziója igen könnyen bekövetkezik, de csak egy másik gén (Dt) jelenlétében. Ha a reverzió megtörténik, az stabil allélhoz vezet, a Dt kikeresztezése után is stabil A1 allél marad vissza. Mai ismereteink birtokában az eredmények egyáltalán nem meglepőek: az a1 fenotípus egy defektív, önmagában elmozdulásra képtelen elemnek az A1 allélba való inszerciója folytán alakul ki, aminek további mozgásához szüksége van egy transz-faktorra, a Dt lókusz termékére.

McClintock  kísérletei

Barbara McClintock az 1950-es évek elején analóg helyzetet talál, szintén kukoricában. talált egy genetikai faktort, a Ds (Dissociation) elemet, amelynek megjelenése komoly mértékben megnöveli a kromoszómatörés valószínûségét az adott helyen. A törések lokalizációja történhet citológiailag, vagy recesszív allélek felfedésével, azaz a pszeudodominancia alapján. A Ds tehát az instabilitás egy másik formáját jelenti, és függ egy nem kapcsolt gén, az Ac (Activator) jelenlététõl.
McClintock lehetetlennek találta az Ac és Ds elemek térképezését, mert azok helyüket változtatták. A Ds elem egy karon belüli helyváltoztatását a különféle gének recesszív alléljainak pszeudodominanciájának a nyomonkövetésével.



21-37. ábra.


21-38. ábra.  

A 21-38.ábrán lévõ keresztezés (amelyen az Ac+ ill. Ds+ az adott elemek hiányát jelenti), a várt eredményt hozta, egy “kivételes” mag esetében pedig a Ds elem a C génbe ugrott, és azt instabil cu  alléllá konvertálta. A “foltokra” minden esetben jellemzõ, hogy ha az õket létrehozó esemény ( a kromoszómatörés a sötét alapon színtelen foltos, a Ds elem kiugrása a cu-C reverziónál) elõbb következik be, akkor nagyobb lesz a folt, ha késõbb, kisebb.




21-39. ábra.   

A kukorica kontroll elemeinek általános sajátságai

Mára több, az a1-Dt és Ds-Ac rendszerhez hasonló rendszert találtak kukoricában. Mindegyiknél fellelhetõ az inaktiválódó “target” gén, amelybe a legtöbb esetben egy receptor-elem ékelõdik bele, valamint egy távoli regulátor gén (elem), amely fenntartja a lókusz mutációs instabilitását, valószínûleg azzal, hogy elõsegíti a receptor elem “kiugrását” a target génbõl, amitõl annak funkciója visszaáll. A receptor-és regulátor elemet együttesen kontroll elemeknek nevezzük.
Az elemzett példákban az instabil allél nemautonóm (nonautonomous), hiszen csakis a regulátor jelenlétében revertál. Ritkán, de – mint az Ac-Ds rendszernél szépen láthattuk – létrejöhet olyan instabil allél, amely autonóm. Ez a fajta mutáció úgy mutat mendeli számarányokat (pl. színes: foltos), hogy függetlenek minden más elemtõl/géntõl. Ilyen esetekben az Ac elem maga inszertálódott a target génbe. Az ilyen allél aztán nemautonómmá transzformálódhat, ekkor  Ac-Ds átalakulás történik, azaz a Ds minden bizonnyal az Ac elem nem teljes (inkomplett) változatai.


21-40. ábra.

A kontroll elemek molekuláris analízise

A Wx-lókusz molekuláris szintû ismerete, és izolálása lehetõvé tette a klónozott vad típusú Wx allél segítségével az instabil mutánsokból készült teljes genom DNS-bõl a mutáns allél, az instabil allélek revertánsaiból pedig a revertáns allélek izolálását. Az allélokat minden esetben megszekvenálták (a szekvenciázás kifejezés is használatos). Az eredmény mindenben megfelelt az elvárásoknak. A két végen imperfekt ripítek voltak, találtak a transzpozáznak megfeleltethetõ ORF-et, és a leghosszabb változat megfelelt az Ac, a rövidebbek, amelyek ugyanazon szekvencia hiányos változatai, a Ds elemeknek.



21-41. ábra.
  

Az inszertálódott transzpozont – a transzpozonoknál megszokott módon – a target gén egy kis szakaszának (adott esetben 8 bázispárjának) duplikációja szegélyezi. A duplikáció általában imperfekt. A revertánsokban a 8bp duplikáció megmarad, bár egy kis módosulása szükségesnek tûnik a megfelelõ leolvasási keret kialakításához. Az áthelyezõdés az Ac-Ds rendszerben DNS-intermedieren át történik


21-42. ábra.   


Az eukarióták transzpozábilis elemeinek áttekintése
  1. Transzpozábilis elemek minden sejtben jelen vannak. Az élesztõ, Drsophila, és a kukorica elemei, valamint az emlõsök retrovírusai a leginkább ismertek.
  2. A prokariótákéihoz hasonlóan, az eukarióták transzpozonjainak áthelyezõdése új helyre is rövid, ismétlõdõ szakaszt hoz létre a célhelyen.
  3. Különbséget jelent, hogy a prokarióták transzpozonjai sohasem helyezõdnek át RNS-átmeneti formán keresztül.
  4. Az eukarióták transzpozonjai széleskörûen felhasználhatóak a molekuláris biológiai munkákban: segítségükkel gének vihetõk be, gének jelölhetõk meg (“tag”), és/vagy izolálhatók.