|
A génexpresszió szabályozása -II.
- a lac, ara és trp operonok - Prokarióta szabályozási pontok - eukariota génexpresszió Prokariótákra
jellemző:
 Transzkripció A gén szerkezete: kódoló rész + transzkripciós szignálokat tartalmazó 5' és 3' (upstream / downstream) elemek: promoter, operátor, aktivátor, terminátor szekvenciák A szabályozó elemek az RNS polimeráz működését irányítják. Az RNS polimeráz Egy enzim írja át az összes gént. Több alegység: core és holoenzim.  RpoA fehérje - alfa alegység - promoter felismerés, aktivátorokkal kölcsönhatás, komplex összeépülés RpoB fehérje - béta alegység, a béta vesszővel együtt a katalitikus centrum, a polimerizációért felelős RpoC - béta vessző alegység: a bétával együtt a katalitikus centrum, a polimerizációért felelős, külön gén és fehérje, de nagyon hasonlít az RpoB-re. A core polimeráz önmagában képes a polimerizáció folytatására, de iniciációra nem. Ehhez szükséges még a szigma alegység (core és szigma = holo enzim) RpoD - szigma alegység - promoter specifitás, fontos génexpressziót szabályozó elem (lásd később) Fogalmak: transzkripciós „buborék” a kétszálú DNS-en létrehozott rövid szakasz, ahol a H-híd kötések nem tatják össze a DNS-t. Ide épülhetnek be a templát szállal szemben a mRNS-t alkotó bázisok. A „kódoló szál” az 5’-3’ irányban felírt gént tartalmazó DNS szakasz „fölső” szála, amelynek szekvenciája megegyezik a szintetizált RNS szekvenciájával (de T helyett U). Az RNS polimeráz kötődik a ketős szálú DNS-hez bárhol (zárt komplex), de az iniciáció csak a megfelelő promoter szekvencián és szigma faktor jelenlétében lehetséges. Nyitott komplex: a megfelelő promoter szekvenciánál a polimeráz elválasztja a két DNS szálat egymástól egy 12-14 bp szakaszon. A transzkripció elindulásához (iniciáció) szükséges tényezők: promoter szekvencia, szigma faktor, templát DNS, megfelelő ribonukleozid trifoszfátok: ATP, UTP, CTP, GTP). A transzkripció 5’-3’ irányú, a sikeres iniciáció után a szigma faktornak már nincs szerepe, leválik. Az elongáció vagy lánchosszabítás addig tart, míg a polimeráz egy transzkripció terminációs DNS szignálhoz nem ér. Ekkor bekövetkezik a termináció, abbamarad az RNS szintézis.
A transzkripció kezdőpontját befolyásoló DNS-szakaszokat bioinformatikai eszközökkel is megkereshetjük. Sok promoter régió DNS szekvenciájának összehasonlítása alapján (E. coli , „erős” promoterek) találták meg, majd footprinting kísérletekkel igazolták az alap promoter felépítését:  Az alap promoter két szakaszból áll: -10 -es szekvencia v. TATA box
-35 -ös szekvencia A transzkripció kezdőpontja a +1 bázisnál található. Ez az RNS-be beépülő első bázis. Szigma faktorok és reguláció Az RpoD vagy szigma 70 az alap szigma faktor, amely a fenti promoter szekvencia felismerését teszi lehetővé. Vannak más szigma faktorok, amelyek különböző környezeti tényezők hatására vagy regulációs kaszkádok aktiválódásakor jelennek meg és speciális, eltérő promoter szerkezettel rendelkező gének átíródását biztosítják a core polimerázhoz kapcsolódva. Tehát a szigma faktorok szerepe a differenciált génexpresszió megvalósításában fontos. Minden szigma faktor ugyanabba a fehérjecsaládba tratozik, kivéve a szigma54 .  Az RpoH vagy szigma32: A hőmérséklet emelkedésére megjelennek a hőstressz (heat shock) fehérjék, amelyek között számos ún. dajkafehérje (chaperon) található. Ezek segítenek a fehérjék szerkezetének stabilizálásában, a helyes térszerkezet kialakításában. E. coliban 17 olyan hőstressz fehérje található, amely expressziója az RpoH irányítása alatt áll. A részlegesen vagy teljesen denaturált fehérjék felszaporodása a jel az RpoH megjelenésére. Ahogy nő az RpoH aránya a sejtben, úgy szorítja ki az alap szigma faktort az RNS polimeráz komplexből és segíti elő a hőstressz gének átírását. Mivel az RpoH gyorsan degradálódik, a stressz elmúltával a hőstressz gének átírása is gyorsan leáll. Az RpoS (szigmaS) szint a logaritmikus növekedés leállása, a stacionárius fázis kialakulása közben kezd megjelenni, de olyan stressz hatások, mint az alacsony hőmérséklet vagy a magas ozmolaritás szintén aktiválják. RpoE (szigmaE) szintén hőstressz esetében jelenik meg. A periplazmikus térben és a külső membránban felszaporodó denaturált fehérjék hatására aktiválódik egy jelátviteli út, és jelenik meg az RpoE fehérje. RpoN (szigma54): a nitrogénéhezés esetében jelenik meg, amikor az ammónia szintje csökken. Ekkor olyan gének kapcsolódnak be, amelyek más nitrogénforrás felhasználását segítik elő. FliA (szigmaF) a kemotaxissal és a flagelláris apparátussal kapcsolatos gének átírását segíti elő.  A különböző szigma faktorokat tatalmazó RNS polimerázok más és más konzerválódott promoter szerkezetet ismernek fel. Ezek legtöbbje a -10 és -35 régiókban tartalmaz, az alap promoterétől eltérő, jellegzetes DNS-szekvenciákat. A szigma faktor direkt érintkezik a -10 és -35 szekvenciákkal. Mutációs elemzések szerint a promoter szekvenciában bekövetkező, a felismerést rontó mutáció hatása a szigma faktort kódoló génben bekövetkező mutációval semlegesíthető, azaz a mutáns szigma faktor a mutáns promotert fel tudja ismerni.  A szigma faktor alegységben ezek a mutációk aminosav cseréket eredményeznek, és a C-terminális szakaszon helyezkednek el. A -10 szekvenciával kölcsönható rész a 400. aminosav környékén, míg a -35 szekvenciával kölcsönható rész a 600. aminosav környékén található (2.4 és 4.2 szakaszok az ábrán). Ez a két régió alkotja együttesen az ún. helix-turn-helix DNS kötő domént, amely jellemző sok, DNS-szekvenciát felismerő fehérjére.
 A
szigma faktorok alkothatnak regulációs kaszkádot Jellegzetes példa erre a Bacillus subtilis sporulációjának szabályozása, ahol az egyes differenciálódási (spóra kialakulásához vezető) lépéseket irányító gének bekapcsolásának sorrendjét különböző szigma faktorok megjelenése határozza meg. Ehhez hasonló, de egyszerűbb a B. subtilis SPO1 bakteriofág fertőzésénél található kaszkád. A korai gének promoterét még a baktérium alap szigma faktorát tartalmazó polimeráz ismeri fel. A korai gének között van egy speciális szigma faktort meghatározó gén is (gp28). A korai fázisban nagy mennyiségű gp28 fehérje készül, amely „lecseréli” az alap szigma faktort. A gp28-tartalmú polimeráz már nem írja át a bakteriális géneket, de intenzíven expresszálódnak a „középső fázis” génjei. Ezek között szintén van két gén, amelyek egy dimérből álló speciális szigma faktort kódolnak (gp33 és gp34). Ezek felszaporodása teszi lehetővé a késői fázis génjeinek átíródását. Tehát minden egyes cserénél az RNS polimeráz más és más promoterrel rendelkező gének átírását végzi, és abbamarad az ezektől eltérő promoterszerkezettel rendelkező gének átírása. (A lambda fág antiterminációra alapozott szabályozása ugyanezt a feladatot máshogyan oldja meg, lásd később). Az operátor és aktivátor régiók A represszor-korepresszor vagy a repesszor inducer nélküli kötődése az operátor régióhoz gátolja a transzkripciót (az RNS polimeráz kötődését vagy haladását). Az aktivátorfehérje szintén jellegzetes kötőhelyet ismer fel, a fehérje jelenléte elősegíti az RNS polimeráz kötődését - gyakoribb, erősebb a transzkripció (lásd részletes példákkal a lac és az ara operon szabályozásánál).
A transzkripció termináció  Prokariótáknál, mivel sok gén egy
transzkripciós
egységet alkotva átíródhat egyetlen promoterről is, különös jelentősége
van a
különböző transzkripciót leállító terminációs szignáloknak. A
génszabályozás
fontos eleme ez a pont is.Általánosságban jellemző, hogy a terminációs szignált jelentő DNS-szekvencia átíródik az RNS molekulába és önmagában vagy fehérje faktorokkal együtt az RNS polimeráz működését leállítja. Feltétel nélküli vagy Rho-független termináció
 Az
antiterminációVannak fehérjék, amelyek a terminációs szekvencia hatását szüntetik meg. Ezek az antiterminátor fehérjék vagy faktorok, amelyek egy transzkripciós egység terminációs helytől 3' irányban lévő cisztronjainak expresszióját teszik lehetővé. A lambda fág fertőzésekor a nagyon korai, korai és késői gének expressziója ilyen antiterminátor (és ezekkel összhangban keletkező represszor) fehérjék megjelenésétől függ. (Ugyanezt a SPO1 B. subtilis fág szigma faktorok segítségével "oldja meg".) A lambda fág egyik antiterminátora az N fehérje, amely a tL1, tR1 és tR2 terminátor szekvenciáknál segíti elő az RNS-polimeráz továbbhaladását. A nagyon korai génekkel együtt íródik át az N gén is. A fágfertőzés elején felszaporodó N fehérje a tL1, tR1 és tR2 terminációs helyek "semlegesítésével" a korai gének átírását teszi lehetővé. Ezek között szerepel egy másik antiterminátort kódoló gén, a Q. A fehérje megjelenése megszünteti a terminációt a tR' helyen és ezzel lehetővé teszi a késői gének (feji és farki fehérjék kódoló szakaszai ...) átírását. |
||||
 |
