2007.03.07.  

A DNS szerkezete és replikációja  -III.

- DNS felépítés - replikáció mikroszkóposan - a replikáció molekuláris biológiája  - a DNS 50 éve -


   A replikáció vagy reduplikáció a genetikai anyag osztódás előtti megduplázódása, melynek gyorsnak és pontosnak kell lennie. A DNS szintézisét végző első enzimet Arthur Kornberg izolálta E. coli sejteből az 50-es évek végén. Ez volt a E. coli DNS polimeráz I enzime. A tisztított enzim kémcsőben képes volt a jelen lévő DNS megsokszorozására. Azóta számos DNS polimeráz ismert különböző rendszerekből és egyazon szervezetből is.

A legtöbb DNS polimeráz működésének elengedhetetlen feltételei :
  • templát szál , mellyel meghatározza a vele komplementer új DNS szál szekvenciáját
  • primer DNS vagy RNS, mely kijelöli az újonnan szintetizálódó szál kezdőpontját. A polimeráz a primer 3' végéhez kapcsolja az első beépítendő bázist. Ha nincs primer (dupla szálú rész), akkor az enzim nem képes a polimerizációt elkezdeni.
  • prekurzor deoxinukleozid trifoszfátok (deoxiadenozin-trifoszfát vagy dATP, deoxicitidin-trifoszfát vagy dCTP , deoxiguanozin-trifoszfát vagy dGTP , deoxitimidin-trifoszfát vagy dTTP, mindet együttesen rövidítve: dNTP


11-22. ábra:

A replikáció során a DNS polimeráz a készülő lánc 3' végéhez a templát szál szemben lévő bázisával komplementer bázist épít be egy foszfodiészter kötés kialakításával.

   Az E. coli DNS polimeráz I (pol I) nemcsak a polimerizációhoz szükséges 5'-3' polimeráz aktivitással rendelkezik, hanem egy 5'-3' exonukleáz és egy 3'-5' exonukleáz aktivitással is. Ezek a DNS lebontó aktivitások a legtöbb polimeráznál megtalálhatóak és fontos szerepük van a replikáció során (lásd később).

  E. coliban található még egy DNS polimeráz II (pol II) és egy DNS polimeráz III (pol III) enzim is. A pol II valószínüleg a javító (repair) mechanizmusokban játszik szerepet, míg a pol III a replikációt végző fő enzim.

   A DNS polimeráz III holoenzim több mint 20 különböző alegységból áll, tehát sokkal bonyolultabb, mint ez egy polipeptid lánc alkotta pol I. A pol III katalitikus core enzim három alegységből áll: alfa, epszilon és théta.
Az enzim 3'-5' exonukleáz aktivitása fontos a hibajavításnál (proofreading), mely az epszilon alegységhez kötődik. Az epszilon hiányában van polimeráz aktivitás, de nincs hibajavítás, így a szintetizált DNS szál több hibát tartalmaz (lásd: repair, mutátor gének). A pol III enzimkomplex több mint 20 féle alegységből áll (holoenzim), és az új szálakat nagyjából 1000 bázis/sec. sebességgel készíti el (60 kb/min = 1800 kb/ 30 min  = két irányban 3600 kb). A 4700 kb E. coli kromoszóma másolásának nagyjából ezzel a sebességgel kell lezajlania, hogy ideális körülmények között a baktérium minden 40. percben osztódni tudjon.

Ha a DNS-t vasúti sínnek , a talpfákat bázispároknak, a polimeráz komplexet pedig egy vonatnak tekintjük, akkor a replikációs apparátus 3600 km/óra sebességgel halad!

A replikációs villa
Az új szálak szintézise során kialakuló replikációs villa szerkezetét mutatja a 11-21a. ábra.


11-21a. ábra:  A replikációs villa

Az új DNS-szál mindig 5'-3' irányban szintetizálódik. Mivel a két DNS-szál  ellentétes irányultságú, ezért az egyik új szál szintézisének az iránya megegyezik a replikáció (a két szál szétnyitásának) irányával ("vezető szál" szintézise).
A másik régi szállal szemben az új szál szintézise pont a replikáció (a régi szálak szétnyitásával) ellentétes irányultságú. Ez azt jelenti, hogy szakaszosan épülhet csak fel, ahogy újabb és újabb templát szál válik a haladás irányában szabaddá. Ez a "követő szál"


RNS primerek és Okazaki fragmentek

11-21b. ábra:  Az Okazaki fragmentek

  Az új DNS-szál szintézise mindig egy meglévő szál szabad 3' végénél folytatódik a templát szállal szemben, tehát egy már meglévő dupla szálú szakaszt igényel. Ez a szakasz egy ún. primer (egyszálú oligonukleotid, DNS vagy RNS) révén is kialakulhat. A replikáció során a primer egy 8-12 bázis hosszú RNS molekula, amelyet a primáz enzim hoz létre.

  A "követő szál" szintézise kis szakaszokban történhet csak (11-21a ábra). Ez mindig új RNS primer szintézisével kezdődik, és egy 1000-2000 bázis hosszú DNS-szakasz szintézisével folytatódik. Jelenlétüket a replikáció mechanizmusának korai vizsgálatainál kísérletesen is kimutatták. Felfedezőjük után Okazaki fragmenteknek nevezzük őket.

   Az Okazaki fragmentek folyamatos szállá kapcsolásában az első lépés az RNS-primerek eltávolítása, amelyet a DNS polimeráz I enzim végez (5'-3' exonukleáz aktivitás), a második lépés pedig a két szomszédos DNS-fragment között a foszfodiészter kötés kialakítása, amelyet  a DNS-ligáz enzim (11-28. ábra).

11-28. ábra: A DNS-ligáz

A DNS ligáz által katalizált reakció ATP energiájának felhasználásával helyreállítja a cukor foszfát gerinc folytonosságát (foszfodiészter kötés kialakítása).

Az enzim előbb egy aktivált ligáz-AMP formává alakul, ami elég energiával rendelkezik a kovalens kötés létrehozásához.



Helikázok és topoizomerázok

Már eddig is láttuk, hogy a replikációt sok fehérje segíti, melyek közvetlenül nem a DNS-szintézisben, hanem a feltételek megteremtésében vesznek részt. A helikázok a DNS két szálát összetartó hidrogénhidakat bontják, hogy kialakuljon a szabad templát szál. Olyan "gyalogló" fehérjéknek tekinthetők, amelyek a két szál közé ékelődve haladnak előre ATP felhasználásával. Ilyenenk például az E. coli DnaB és Rep fehérjék.

A helikázok és a replikációs folyamat extra csavarodást okoznak a DNS spirálon. A topoizomeráz enzimek ezt "oldják" vagy egy "ellazult" DNS kettős helixbe extra csavarodásokat vihetnek be. Igy jöhet létre a "supercoiling" DNS például a DNS giráz működése következtében (lásd CCC plazmid forma).

Az I. típusú topoizomeráz enzimek egy szálon képesek csak megszüntetni a cukor-foszfát gerinc folytonosságát, így a "túlcsavarodott" spirál a másik, épen maradt kötés mint tengely segítségével "kipöröghet", a feszültség megszűnik.

A II. típusú topoizomeráz enzimek mindkét szálat elvágják, ezáltal a replikáció végén "összeakadt" két új DNS gyűrű szétbontását oldják meg.

Az SSB ( single strad binding) fehérjék stabilizálják a szétvált szálakat úgy, hogy hozzájuk kötődnek, megakadályozva ezzel az újbóli összekapcsolódást.

Primosome (primoszóma)
A replikáció megkezdéséhez primerre van szükség, amely segítségével létrejön egy rövid kettős szálú szakasz. A primer egy 8-12 bázis hosszúságú RNS molekula, melyet a primáz enzim készít. Az enzim több más fehérjével együtt alkotott komplexe a primiszóma , melyben helyet kap, többek között a DnaB, DnaT, PriA, PriB, PriC fehérje is.


11-21. ábra: A replikációban részt vevő fehérjék és a replikációs villa felépítése  (E. coli rendszer.)

Az ábra térben kiterítve mutatja a replikációs villát. A valósághoz közelebbi kép a 11-30 ábrán látó.
alkotóelemek:
topoizomeráz
helikáz
SSB fehérjék
primosoma,
primase, DnaB, DnaC, DnaT
priA, priB, priC
primer
DNS polimeráz III
DNS polimeráz I
DNS ligáz

A replikációs villában egy enzimkomplex (repliszóma, replisome) szintetizálja mindkét új szálat, melynek felépítése a 11-30. ábrán felvázolt modell szerint képzelhető el. A követő szál szintézise a templát szál hurkolódása segítségével haladhat a replikációs villa haladási irányával megegyezően.



11-30. ábra :

A replikációs komplex modellje.

Mindkét új szál szintézise azonos irányban halad a villa nyitásával. A követő szál templátja hurkot képez a komplexen belül, hogy ez megvalósulhasson.



Prokarióta sajátságok

A prokarióták általában egy kör alakú kromoszómával rendelkeznek, amin egy replikációs kezdőpont, az  oriC,  található. Ennek első látható bizonyítékát szolgáltatta a 11-19. és 11-20. ábrákon bemutatott kísérlet.
Az oriC lokusz 
245 bp hosszú, a perctérképen 83 min. pozícióban helyezkedik el, és 3 tandem, egy irányba mutató, nagyon hasonló, 13 bp hosszú szekvencia és 4 DnaA kötőhely alkotja. Az iniciáció - kitekeredés - a DnaAfehérje kötődésével kezdődik. Ezek után épül fel a replikációs komplex (11-24 ábra).


11-24. ábra:
Az E. coli oriC régiója, a replikáció elindításához szükséges szerkezeti elemek.
Terminus vagy ter szekvenciák (terDA és terCB,) jellegzetes 23 bp szekvencia az alkotóelemük, a replikáció ezeknél áll le. A két ellentétes irányból érkező replikációs villa mindegyikének van egy ter régiója, mely túl van az ellentétes szálon érvényes ter régión. Ezek orientáció függően állítják le a replikációt.

Eukarióta sajátságok
több, lineáris kromoszóma,
nagyságrendekkel nagyobb DNS állomány,
kromatin szerkezet – hisztonok

Pulzus jelöléssel (triciált timidin) sok replikációs origó lehet kimutatni egy kromoszómán belül (ARS = autonomously replicating sequences). Legalább tízszer lassabb a replikáció sebessége, mint prokariótáknál. A kromoszóma kitüntetett részei az ARS mellett a centromeron és a két telomer szekvencia, melyek mindegyike szükséges a kromoszóma szabályos megkettőződéséhez és az utódsejtekbe való szétválásához.
 
ORC (origin recognition complex) replikációs kezdőpont felismerő komplex
kromoszómánként több 100 vagy ezer replikációs kezdőpont  van





A telomerek replikációjának problémája
Az eddig bemutatott  replikációs mechanizmus működése következtében a lineáris kromoszómák végein az 5' véggel rendelkező szál minden osztódáskor rövidül, mert az első 5' végi RNS-primert nem fogja DNS-szekvencia felváltani.

A telomeráz egyedül álló működése lehetővé teszi a DNS-templát nélküli DNS-szintézist. Ez az enzim ugyanis egy "beépített" RNS-templát szálat tartalmaz, ami egy ismétlődő szekvencia-sorozat kialakítását teszi lehetővé. Így a telomer végének hossza nem függ az általános replikációs apparátustól.

Az eukarióta kromatin jellegzetes alkotói a nukleoszómák, a hiszton oktamerekre feltekercselt DNS. Ez a kompakt szerkezet újabb problémát jelent a replikáció során. Replikáció előtt a nukleoszómákat ki kell "bontani", a hisztonokat el kell távolítani. Az új szálak szintézise után pedig újra fel kell építeni ezt a szerkezetet.


 


- DNS felépítés - replikáció mikroszkóposan - a replikáció molekuláris biológiája - a DNS 50 éve -