2007.02.20.    .
Baktérium- és fággenetika  -VI.
- Alapfogalmak - Konjugáció - Rekombináció fágokban - Transzdukció - Transzformáció - Genetikai térképek -

   Az előző részekben láttuk, hogy milyen jelenségek felfedezése és módszerek kidolgozása kellett a baktériumok és bakteriofágok genetikai térképezéséhez. A klasszikus genetikai munka nagyon precíz és részletes genetikai térképek elkészítését tette lehetővé, amelynek alapját a sokféle módszerrel és rafinált szelekciós eszközökkel izolált mutációk biztosították.

   Az E. coli klasszikus genetikai térképének utolsó kiadása - amely a szekvenálási eredményeket még nem foglalta magába - 2220 gént és 40 egyéb térképezhető markert tartalmazott. A genomszekvencia teljes ismeretében jelenleg több mint 4000 gén meglétét feltételezik. A 10-33. és 10-34. ábrákon az E. coli cirkuláris genetikai térképe illetve annak egy részletesebb szakasza látható.



 10-33. ábra:  Az E. coli kromoszómatérképe egy 90 perces körön ábrázolva (nagyítható).  Ha 4700 kb  90 perc, akkor 1 perc durván 50 kb.

10-34. ábra: Az E. coli kromoszómatérkép egy 5 perc távolságnyi részletének markersorrendje (nagyítható).

  A DNS-szekvencia meghatározás és a teljes genomszekvenálás előtti időkben a legnagyobb felbontást E. coli esetében a P1 fággal végzett kotranszdukciós térképezés (általános transzdukció) szolgáltatta. A 10-32. ábra egy néhány génből álló szakasz  térképét mutatja be. A szekvenciaadatok alapján például az ábrán látható hemA - narC régió valójában 17621 bp hosszúságú. 


Molecular and General Genetics 105: 285- (1969)
10-32. ábra: Kotranszdukciós térkép

Egy P1 kotranszdukcióval készült részletes genetikai térkép. A számok a kotranszdukciós gyakoriságokat jelzik, ezért nem additívak.

A perctérképen a purB a 23 min., a cysB a 25,3 min. értéknél helyezkedik el, tehát ez a régió nem egészen 2,5 min. nagyságú és durván 100 kb méretűre becsülhető.

A hemA - narC régió szekvenciája és a szekvencián behatárolt géneket a D90757 regisztrációs számú Nukleotid Adatbázis rekord tartalmazza (többek között) A narC az új nevezéktan szerint a bisD nevet viseli, korábban narG-nek is hívták.  Az adatbázis rekord egy részlete jól példázza, hogy a mutációval azonosított, és enzimaktivitás szintjén is ismert funkciók mellett számos feltételezett, ismeretlen funkciójú fehérjét kódoló nyitott leolvasási keret is található a szekvenciában (10-32a ábra).


10-32a ábra: A D90757 regisztrációs számú Nukleotid Adatbázis rekord egy részlete.
A rekord megadja a gének koordinátáit az adott szekvencián belül. Az ábrán az első kódoló szekvencia az 1218. bázisnál kezdődik (az ATG startkodon első betűje), és a 2051. bázisnál,  a stopkodon  utolsó betűjénét fejeződik be. A gén a hemK nevet viseli, és a "protoporphyrinogen oxidase" enzimet kódolja. A géntermék nukleotidszekvencia alapján következtetett aminosav sorrendje is szerepel a rekordban.
A második, ábrán feltüntetett (feltételezett) gén funkciója ismeretlen. A nyitott leolvasási keret koordinátái: 2048. .2440. A feljegyzésben csak annyi szerepel, hogy egy ismert fehérjéhez hasonló fehérjét kódol (similar to PIR I83571, ami egy fehérjeszekvencia kódja), és hogy  feltételezetten a megadott aminosavszekvenciájú fehérjét kódolja (hypothetical protein).


Az E. coli K12 törzsről jelenleg fellelhető ismeretek az interneten keresztül is elérhetők.

CGSC: E.coli Genetic Stock Center : http://cgsc.biology.yale.edu/
A szekvencián alapuló publikált térképtérkép (1998) pedig a http://mmbr.asm.org/cgi/content/full/62/3/814/F1  
címen tekinthető meg. Ennek egy részletét mutatja a 10-40 ábra. 



10-40 ábra:

A E. coli  szekvenálási adatokat is magába foglaló genetikai térképének  első 16 percnyi részlete a bal oldalra klikkelve kinagyítva megtekinthetô.

Genomszekvenálás, genetikai térképezés, fordított genetika
A hosszú időt igénylő és fáradságos genetikai munkát napjainkban felváltja (vagy részben megelőzi) a genomszekvenálás. Közel négyszáz baktérium (Bacteria, Archaea) genomjának szekvenciáját meghatározták már anélkül, hogy az E. coli hoz hasonló részletes genetikai térkép (és előtte a hozzá tartozó mutánspark) elkészült volna. Természetesen az ismeretlen szekvenciák számítógépes kiértékelésekor az E. coli és más élőlények genetikailag, és szekvencia szinten is ismert génjeivel való hasonlóságokat vették és veszik alapul. 

  A genomprojektek nagy tőkekoncentrációt és informatikai hátteret igényelnek. A szekvencia alapján elkészített géntérképek (ismert génekkel való hasonlóság alapján feltételezett funkciójú gének sorrendje a szekvencián) valójában nem genetikai térképek. Nem rekombinációs térképezéssel jöttek létre, és nem ismert az egyes feltételezett gének mutáns fenotípusa sem. Természetesen, ha a gének egymáshoz viszonyított helyzete a szekvencia meghatározásával már ismert, rekombinációs térképezésre nincs szükség.

 A genetikai munkát azonban nem helyettesíti, csak megelőzi a genomszekvenálás. 
Egy gén funkciójának bizonyítására mindig kísérletes, genetikai, molekuláris biológiai munkára van szükség.

A "fordított genetika" kifejezés azt jelzi, hogy a modern módszereknek köszönhetően sokszor előbb ismerjük meg egy DNS-szakasz, akár egy teljes genom szekvenciáját, és csak ez után kerül sor a mutánsok elkészítésére, elemzésére. A "klasszikus" megismerési út ennek fordítottja. A mutáns izolálásával kezdődik, folytatódik a mutáció térképezésével, a fenotípus jellemzésével,  az adott gén izolálásával, és zárul a DNS-szekvencia meghatározásával.

A baktériumgenetika haszna
   Ahogy láttuk, kezdetben alapvető kérdések megválaszolása volt a cél: vannak-e szexuális folyamatok, van-e rekombináció, lehet-e térképezni a éneket? Mivel ezekre igen volt a válasz, olyan egyszerű és olcsó kísérleti rendszerek létrehozására nyílt lehetőség, amelyekben az alapvető, genetikai, biokémiai folyamatokat mutánsok létrehozásával lehetett tanulmányozni. Milyen génekkel kell rendelkeznie egy egysejtű szervezetnek,  mi a genetikai háttere a különböző anyagcsere folyamatoknak,  milyen genetikai szabályozási módok lehetségesek ... stb? Bonyolultabb eukarióta ksérleti rendszeren a legtöbb kérdés megválaszolása  lehetetlen vagy jóval költségesebb.
A baktérium- és fággenetika fejlődése vezetett el, többek között, a plazmidok és restrikciós modifikációs rendszerek megismeréséhez, így a molekuláris klónozás technikájának kifejlődéséhez. és végső soron bármilyen gén DNS-szekvenciájának megismeréséhez.
   A különböző baktériumok génjeinek megismerése ma is fontos kutatási cél. Most azonban a speciális tulajdonságokat hordozó gének kerültek az érdeklődés középpontjába. Patogén, szimbionta vagy extrém körülmények között élő fajoknál szeretnénk azokat a géneket megismerni, amelyek a különleges környezethez való alkalmazkodásban játszanak szerepet.

Azoknak a mikroorganizmusoknak a listája, amelyeknek teljes genomszekvenciáját már meghatározták a következő internet címen érhető el: 

http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html

A folyamatban lévő genomprojektek listája szintén megtalálható a fenti honlapon:

http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbinprogress.html

Az internet napjainkban már elsődleges forrása a genomokkal kapcsolatos információknak. 
Igy természetesen megtaláljuk a klasszikus munkákból megismert T4 és lambda fág (10-41. ábra) teljes szekvenciáját, genetikai térképét is.

A lambda fág genetikai térképe.
10-41. ábra:



(nagyítható)
 t4

A T4 fág genetikai térképe.

A baktériumgenomok evolúciója

  Az előzőekben láthattuk, hogy a baktériumok genomjának fejlődését döntő mértékben segítik a széles gazdaspecifitású, konjugatív plazmidok, az aktív transzformációs mechanizmusok, és részben a bakteriofágok is. Nemcsak fajon belül, hanem fajok között is lehetővé teszik a hasznos gének cseréjét, "kifejlesztését". Egy baktérium fajon belül akár 30 % eltérés is lehet a gének számát, milyenségét illetően. Genetikai információ átadás tekintetében elmosódnak a faj határai. A horizontális géntranszfer révén távoli fajok között is áramlik a genetikai információ. A genomprojektek eredményeként világossá vált, hogy számos esetben egy  bakteriális genom (kromoszóma) jelentős része idegen eredetű, más baktériumfajokból származó géneket tartalmaz.
   Az "idegen" gének gyorsabb áramlását és kromoszómától független fennmaradását segítik a konjugatív plazmidok, ha azok az adott fajban képesek önálló replikációra. Így a bejutott gének megmaradása nem igényel rekombinációs folyamatokat.

 
A genomprogramokról, a DNS- és fehérjeszekvenciák összehasonlításáról és elemzéséről további ismeretek nyerhetők a BIOinformatika kurzuson és honlapon .

- Alapfogalmak - Konjugáció - Rekombináció fágokban - Transzdukció - Transzformáció - Genetikai térképek -