2007.02.18.   .
Baktérium- és fággenetika -IV.

- Alapfogalmak - Konjugáció - Rekombináció fágokban - Transzdukció - Transzformáció - Genetikai térképek -

10-19a ábra:
Egy lambda fág megtapadása az E. coli sejten
10-19b. ábra:
Az E. coli sejtben kialakuló lambda fágrészecskék.
10-27. ábra:
Egy lambda fág

Lizogenitás

    Bizonyos fágokkal való fertőzéskor nem minden baktérium pusztul el. A plakk területéről izolálni lehet túlélő sejteket. Ezek általában "immunisak" lesznek az ugyanazzal a fággal való felülfertőzéssel szemben. Az "immunis" baktérium fágot bocsájthat ki a környezetébe. Ez spontán következik be, vagy környezeti tényezők indukálhatják (pl. UV). A fágot kibocsájtó baktérium a lizogén baktérium .

André Lwoff 1940. körül Bacillus megaterium rendszeren fedezte fel a lizogenitás jelenségét. Tizenkilenc generáción keresztül követte a baktériumok osztódását és vizsgálta a "szabad" fágrészecskék jelenlétét. Megállapította, hogy minden utód lizogén, a lizogenitás öröklődő tulajdonság.
A baktériumban rejtőzködő fág a profág.
A virulens fágok nem tudják lizogenizálni a gazdájukat. Erre csak a temperált (mérsékelt) fágok képesek, melyeknek lizogén és lítikus szaporodási útja is lehetséges (lásd: 10-26. ábra ).

A lizogenitás genetikai alapjai

   Mi a profág?, Hol van a baktériumban? Véletlenül az első, Lederberg és Tatum által használt E. coli törzs is lizogénnek bizonyult, egy lambda fág profágkén volt benne! Ez lehetővé tette a profág genetikai tanulmányozását egy ismertebb rendszerben.

keresztezések : 
F+   x    F- (lambda) lizogén rekombinánsok
F+(lambda)    x     F- szinte soha nem lizogének a rekombinánsok
Hfr    x   F- (lambda) markerek átjutása normális
Hfr(lambda)     x     F- korai markerek jutnak csak át

   A lambda profág egy — a gal génhez közeli — kromoszómális lókuszként viselkedik. A Hfr(lambda) x F- keresztezésben "zigotikus indukció" történik, azaz a lambda fág lítikus szaporodási ciklusa indukálódik. A Hfr  x  F- (lambda) keresztezésekben ez az indukció nem történik meg (10-28. ábra). A zigotikus indukció jelenségét azzal magyarázták, hogy a lizogén baktériumban egy gátló faktor (represszor) termelődik, amely megakadályozza, hogy a fágszaporodás a lítikus irányba tolódjon el. A nem lizogén recipiens sejtben ez a faktor nincs jelen, így a konjugációkor bejutó lambda genom lítikus szaporodáshoz szükséges génjei expresszálódhatnak. Ma már tudjuk, hogy ez a faktor fág fő represszor fehérjéje, a cI (ejtsd c-egy) gén terméke.

10-28. ábra:
 
A zigotikus indukció

Ebből az is következik, hogy a Hfr x F- (lambda) keresztezésben a beépülés helye térképezhető. A profág jelenléte növeli, hiánya csökkenti a két oldalán lévő markerek közötti távolságot. Kísérletekkel mindkettőt igazolták és megállapították, hogy minden egyes esetben a gal és bio gének közé épül be a lambda fág.

Transzdukció

   A transzdukció fág által közvetített géntranszfer baktériumokban. Ebben az esetben a donor baktérium az a törzs, amelyen a transzdukáló fágot elszaporítják, a recipiens baktérium pedig az, amelyiket az így létrehozott transzdukáló fágpopulációval fertőznek.

   A transzdukció felfedezése Lederberg és Zinder (1951.) nevéhez fűződik. A már többször emlegetett U-csöves kísérletet elvégezve egy kísérletben azt tapasztalták, hogy a baktériumszűrő nem akadályozta meg a prototróf rekombinánsok megjelenését. Csak jóval kisebb pórusméretü szűrő bizonyult hatásosnak, amely már a bakteriofág méretű részecskéket sem engedi át. Így fedezték fel a Salmonella P22 transzdukáló fágját.

   A véletlenek viszik előre a tudományt ? Ebben a felfedezésben a véletlennek biztos szerepe volt. Ugyanis az általános transzdukció felfedezésekor a recipiensben lévő phe, trp, tyr gének olyan közel voltak egymáshoz, hogy a mindhárom gént hordozó DNS belefért a fágfejbe. Enélkül nem keletkezhettek volna (+ + +) rekombinánsok, és így a jelenséget sem fedezhették volna fel.

Általános transzdukció

10-30. ábra:
Az általános transzdukció.

Néhány fágrészecske csak baktérium DNS-t tartalmaz. Ha a- sejtekkel hozzuk össze az a+ sejten növesztett fágpopulációt, akkor kimutathatjuk az a+ marker átjutását, transzdukcióját.

    Általános transzdukció segítségével bármilyen helyzetű gén átvitele lehetséges. Általános transzdukciót végző fág például az E. coli P1 fágja. Ebben az esetben a fágrészecskék érése során a kialakuló fágfejbe, nagyon ritkán és véletlenszerűen, bakteriális DNS kerül (fág DNS nem). A legtöbb fág nem hordoz bakteriális DNS-t. A bakteriális DNS-t hordozó fágrészecske fertőzőképes (azaz képes a benne lévő DNS bejuttatására), de természetesen elszaporítani nem lehet. Olyan mint egy trójai faló, az idegen DNS általa jut be a baktériumsejtbe és rekombináció után a bejuttatott marker (gén) kicserélődhet a baktériumtörzsben lévő eredeti markerrel. Megfelelő szelekciós rendszer esetén a rekombinánsok kimutathatók.

Speciális transzdukció

    A speciális transzdukció esetén a transzdukáló fág csak néhány meghatározott kromoszómális marker átvitelére képes. A jelenséget a lambda fág — E. coli rendszeren fedezték fel és tanulmányozták behatóbban. A lambda fág, mint temperált fág, profágként a baktérium kromoszóma specális helyén (attB) képes integrálódni a genomba (10-31a. ábra).

 

10-31a. ábra: A lambda fág integrációja, amelyben az attB (bakteriális szekvencia,
vastag fekete vonallal jelölve a gal és bio markerek között) és az attP régió vesz 
részt. Specifikus rekombinációs rendszer szükséges a kivitelezéshez (lásd később).

   Hibás kivágódás esetén az attB régió közelében lévő gal gén részévé válhat a fággenomnak, csak ezt a baktériumgént képes a fág a recipiensbe átjuttatni. Ez a transzdukáló fág egy defektív fág, a lambda dgal, mivel fággének maradtak a kivágódás helyén (10-31b. ábra). Ez a fág nem tud ismét integrálódni, csak, ha egy "helper fág" segít ebben, amely hordozza a defektív fág hiányzó génjeit. A transzdukáló fág tehát csak a gal gént és közvetlen környezetét hordozza.


10-31b. ábra: A normál fágkivágódás és a speciális transzdukáló fág létrejötte.

Transzdukció és genetikai térképezés

   Az általános transzdukció "finomtérképezésre" használható, mivel sokkal kisebb távolságok között lehet a segítségével rekombinánsokat elemezni, mint a konjugáció segítségével. Viszont nagyobb távolságban lévő gének térképezésére egyáltalán nem alkalmas, mivel a fágfejbe nem fér bele 50-100 génnél (50-100 kb) hosszabb DNS-szakasz. Ezért nem keletkezhetnek távolabbi markerek közötti rekombinánsok, így nem "mérhető" a távolságuk sem. A kotranszdukció több marker együttes átjutása és beépülése, amely a térképezés előfeltétele. A transzdukáló P1 fágnak nagy szerepe volt az E. coli genetikai térképének pontosításában. Lásd: Genetikai térképek - 10-32. ábra:


- Alapfogalmak - Konjugáció - Rekombináció fágokban - Transzdukció - Transzformáció - Genetikai térképek -