Baktérium- és fággenetika

2007.02.10. .

Baktérium- és fággenetika -III.

- Alapfogalmak - Konjugáció - Rekombináció fágokban - Transzdukció - Transzformáció - Genetikai térképek -

A bakteriofágokkal (továbbiakban fágokkal) a genetikai munka egyszerű, anyagigénye is szerény, mégis alapvető fontosságú eredmények születtek az E. coli T2 és T4 fágokkal történő kísérletekből (lásd később Benzer és Brenner munkáit), nem is beszélve a lambda fággal kapcsolatos későbbi eredményekről.

A fág táptalaja a megfelelő gazdabaktérium, amelyet egy lágyabb, ún. "fedőagar" réteg hordoz. A fedő réteg 0,8 % agart tartalmaz, amelybe — kb. 40 ^oC-os folyékony állapotában — belekeverik a baktériumot és a megfelelően higított fágot. A fágok a növekvő "baktériumpázsiton" szaporodnak. Egy fágrészecske fertőzése után néhány órával kiszabaduló utódok megfertőzik a közeli baktériumokat és több cikluson keresztül így alakul ki a baktériumpázsiton a "tarfolt" (plaque v. magyarul plakk 10-21 ábra). Nagyon kevés fenotípus köthető a plakkhoz. Lehet kicsi vagy nagy, zavaros (turbid) és tiszta (clear). Ez utóbbi kettő azt jelzi, hogy a fág nem képes minden baktériumot elpusztítani a tarfolt területén (turbid plaque) vagy képes erre (clear plaque).

10-21 ábra: Bakteriofág tarfoltok egy baktériumpázsiton.

10-17 ábra: A T4 fág felépítése

A fágokat jellemezi a gazdaspecifitás, a "host range", amely azt jelzi, hogy a fág (vagy annak mutánsa) mely baktériumtörzsön képes szaporodni. A legtöbb fággénben létrehozott mutáció "letális" azaz lehetetlenné teszi a fág szaporodását. Mivel a fágok haploid genommal rendelkeznek, ezért ezek a mutációk csak akkor detektálhatók és tarthatók fent, ha feltételesen letálisak, azaz van olyan körülmény (hőmérséklet vagy baktériumgazda), amely a mutáció ellenére megengedi a mutáns fág szaporodását ("permisszív" körülmények). Nagyon sok fágmutáció hőérzékeny (ts = thermosensitive) mutáció, amely csak magasabb hőmérsékleten (37 - 42 ^oC) eredményezi pl. egy életfontosságú fehérje instabilitását ("restriktív" hőmérséklet). De a fággenetikában jól alkalmazható az ún. "amber" mutáció is. Ebben az esetben a mutáns egy idő előtti STOP kodont hordoz valamelyik kódoló régióban, így rövidebb fehérje keletkezik transzlációkor. Ez önmagában letális, de egy megfelelő, ún. amber szupresszormutációt hordozó gazdán az amber mutációt hordozó fág képes szaporodni (lásd később -szupresszor mutációk).

Egy fág lehetséges szaporodási módjait mutatja a 10-26. ábra. Nem minden fág tud lizogén úton szaporodni (profággá alakulni), csak a "temperált" vagy mérsékelt fágok. Ezek képesek speciális transzdukcióra (lásd később). Más fágok csak litikus úton sokszorozódnak, a 12-26. ábra bal alsó felén látható módon.

l0-26. ábra: A lítikus és a lizogén szaporodási ciklusok egy temperált fág esetében

Lizogén szaporodás: a fág DNS beépül a baktériumkromoszóma egy adott pontjára (lásd att régió) és a fág DNS (profág) a baktérium DNS-sel egyidőben, annak részeként replikálódik vagy a kromoszómától függetlenül, a plazmidokhoz hasonlóan replikálódik és így alakít ki lizogén állapotot (P1 E. coli fág).

Lítikus fágszaporodáskor a fágfertőzés után a fág DNS replikálódik a gazda kromoszómától függetlenül, szintetizálódnak előbb a korai majd a késői fágfehérjék és az elkészült fágrészecskék, általában a baktériumsejt lízise útján, kiszabadulnak a baktériumból. Ezt követően ismételten fetőznek.

Az E.coli fontosabb fágjai: a T "páros fágok" (T2, T4, ...), a "páratlanok" (T1, T7) valamint a lambda, a P1, a Mu, és az M13 fágok. Szinte valamennyinek jelentős szerep jut a genetika és a molekuláris biológia elmúlt 50 évében.

Fágkeresztezés: Alfred Hershey a T2 fág "host range" és plakk morfológiai mutánsaival végzett keresztezéseket, hogy megállapítsa, van-e rekombináció fágoknál illetve milyen gyakran fordul az elő. A kiépített kísérleti rendszer a legérzékenyebb rekombináció detektáló rendszerek egyike lett. A fágmutánsok tulajdonságait a következő táblázat foglalja össze és a 10-23. ábra mutatja be.

fág / gazda E. coli	B törzs	B/2 törzs
T2 `h^-` törzs	nő (+)	nő (+)
T2 `h⁺` törzs	nő (+)	nem nő `(-)`
T2 `r^-` (`h⁺`) törzs	nagy plakk	`(-)`
T2 `r⁺` (`h⁺`) törzs	kis plakk	`(-)`

Ha a pázsit a B és B/2 E. coli törzsek 1:1 arányú keverékéből készül, akkor a h^- fág tiszta plakkot ad a pázsiton (mindkét baktériumot megöli) a h⁺fág pedig zavaros tarfoltot produkál, mert csak a B törzset lizálja (öli meg). Ezért a keverék pázsit alkalmas a különböző fenotípusok elkülönítésére, és így a rekombinánsok detektálására is, ahogy az a 10-23. ábrán látható.

10-23 ábra :

Különböző plakk morfológiájú T2 fágok az E. coli B és B/2 törzsek keverékéből készült pázsiton. A fágok genotípusa a nyilak mellett látható.
plakk méret:
r^- nagy plakk = gyors szaporodás
r⁺ kis plakk = lassú szaporodás

10-22 ábra : A fággenomok közötti rekombinációra lehetőséget nyújtó kettős fertőzés.

A fágkeresztezést úgy lehet kivitelezni, hogy két különböző genitípusú fággal fertőzünk egy olyan baktériumtörzset, amelyen mindkét szülő képes szaporodni. Jelen esetben ez az E. coli B törzs. Ahhoz, hogy sok baktériumsejtben egyszerre legyen jelen midkét fágszülő DNS-e, a fágokat 1:1 arányban kell összekeverni. Legalább 10 fágrészecskének kell egy baktériumsejtre jutnia. Ezt hívják nagy multiplicitással való fertőzésnek, amikor az m.o.i (multiplicity of infection) érték = 10, tehát a fág : baktérium arány = 10.

A keresztezés során létrejövő fágpopulációban található genotípusok meghatározására pedig a B és B/2 törzs keverékével létrehozott pázsit alkalmas (lásd a 10-23 ábrát).

A keresztezésben Hershey a h^-r⁺ és a h⁺r^- genotípusú fágokat használta szülőként. A rekombináns h⁺r⁺ és h^-r^- plakkok egyenlő arányban jelentek meg. Ebből következően van rekombináció ebben a rendszerben is és ez a rekombináció szimmetrikus. A rekombinációs frekvenciát is ki tudjuk számolni a következő képlet alapján :

            h⁺r⁺ és h^-r^-
   RF = ----------------------- (x100), a mely arányos a két marker közötti távolsággal.
           összes plakk

Kiderült, hogy a plakk nagyságát több gén is befolyásolja, mivel az egyes mutánsok keresztezésében a h gén és az r gén távolsága (a rekombinációs frekvencia) különböző értékeket mutatott. Ezért bevezették az r_a , r_b és r_c jelöléseket. A keresztezésekben a genotípusok megoszlása a következő volt :

	szülő	szülő	rekombináns	rekombináns	RF =
	`h^-r⁺`	`h⁺r^-`	`h⁺r⁺`	`h^-r^-`
`r_a^-h⁺` `x r_a⁺h^-`	340	420	120	120	24
`r_b^-h⁺` `x r_b⁺h^-`	320	560	59	64	12.3
`r_c^-h⁺` `x r_c⁺h^-`	390	590	7	9	1.6

A fenti eredményekből négy génsorrend is elképzelhető. Tehát az r_a , r_b és r_c nem allélek, csak a fenotípus azonos, a térképhelyzet nem !

1: ra - rb - rc - h
2: ra - rc - h - rb
3: ra - rb - h - rc
4: ra - h- rc - rb

További keresztezésekkel a különböző r géneket — a h géntől függetlenül — tudták egymáshoz térképezni. Vegyük észre, hogy például az r_c^- r_b⁺ ésr_c⁺ r_b^- szölők keresztezése esetén a szülők és az r_c^-r_b^- rekombináns is nagy plakkot ad, de az r_b⁺ r_c⁺ rekombináns kategória észrevehető, mert csak ez ad kis tarfoltot. Ezek gyakoriságából pedig az r_b és r_c távolságra lehet következtetni.

A további keresztezések során az rc — rb távolság például nagyobbnak adódott, mint 12.3, így a h gén a két marker (rc és rb) közé kell hogy essen. (rb — h távolság 12.3 a fenti táblázat szerint). Tehát a felsorolt négy lehetőség közül már csak a 2. és a 3. lehet igaz (10-24. ábra).

10-24. ábra:

A T2 fág r markereinek a h génhezt viszonyított térképhelyzete és a lehetséges sorrendek a távolságok alpján.

A térképezési munka során meg lehetett állapítani a markerek egymáshoz viszonyított sorrendjét és távolságát is. Itt is adódtak ellentmondások az egyes távolságok kiszámítása után, amelyet csak úgy lehetett feloldani, hogy feltételezték: a T2 genom cirkuláris.

Hasonló genetikai munkával megszerkesztették a T4 fág genetikai térképét is. A 10-25 ábrán látható, hogy a plakk morfológián kívül milyen más markereket (tulajdonságokat) lehetett felhasználni a mutánsok előállítására, jellemzésére.

10-25 ábra : A T2 fá g (a) és a T4 fág (b) genetikai térképe.
Markerek: (r) rapid lysis, (h) host range, (ac) acridine resistance, (tu) turbid plack,
(os) resistance to osmotic shock, (e) lysis defectiv

- Alapfogalmak - Konjugáció - Rekombináció fágokban - Transzdukció - Transzformáció - Genetikai térképek -