2008.02.10.  .

Baktérium- és fággenetika -II.

---

- Alapfogalmak - Konjugáció - Rekombináció fágokban - Transzdukció - Transzformáció - Genetikai térképek -

Joshua Lederberg és Edward Tatum (1946.) kísérletei bizonyították előszőr, hogy van rekombináció baktériumokban is. Többszörösen auxotróf törzseket kevertek össze:

10-4: Lederberg és Tatum kísérlete Külön egyik mutáns törzsből sem keletkeznek prototróf egyedek, csak az összekkeverésük után. Genetikai információ átadás és utána rekombináció történt. MM = minimal medium Később bizonyították (U-cső kísérlet, 10-5 ábra), hogy fizikai érintkezés kell a rekombinánsok megjelenéséhez. Kérdés volt, hogy vannak-e kapcsoltsági csoportok, és hogyan lehet térképezni azokat. A kezdeti kísérletek eredményeit nem lehetett értelmezni, mert nem tudták, hogy a rekombinánsok mely szülő utódai.

10-5: Az U-cső kísérlet - William Hayes A középső szűrő nem engedi meg a két baktériumtörzs keveredését, de a tápfolyadék szabadon áramolhat. Ilyen elrendezésben nem lehetett rekombinánsokat (prototróf telepek) kimutatni. Ebből következően fizikai érintkezés szükséges az A törzs és a B törzs között, hogy rekombináns utódok jöjjenek létre.

10-2: Az F faktor jellemzői Az F-faktort tartalmazó donor törzs pilusokkal rendelkezik. Az F-faktor egy kópiája jut át a recipiens sejtbe. Az F faktor a kromoszómától függetlenül replikálódik.

A 10-6a. ábrán összegzett kísérletben a donor Hfr azi ^R, ton^R ,  (lac⁺, gal ⁺ Str ^S), a recipiens F^- str^R, lac^- , gal^- (azi^S , ton^S ) volt. A streptomicin "ellenszelekciós" eszköz, mert a konjugáció utáni populációban elöli a donor sejteket. A konjugációban részt vett (exkonjugáns) recipiensekben megjelenő donor markerek jelenlétére (a rekombinánsokra) a megfelelő táptalaj megválasztásával lehetett szelektálni.

Például az MM (minimál) táptalajba szénforrásként laktózt alkalmazva és streptomicint téve csak azok a rekombinánsok nőnek, amelyekbe a donorból bejutott a lac⁺ allél. Az összes donor elpusztul a streptomicin jelenléte miatt, és a nem rekombináns recipiensek sem tudnak nőni a laktózon.

10-6a ábra : Perctérképezés A markerek átjutási idejének meghatározása a megszakított keresztezés módszerének segítségével.  Lásd a 10-7. ábrát.

10-7 ábra : Perctérkép a 10-6a ábrán bemutatott kísérlet alapján.

Már kis számú marker (auxotrófiát, vagy valamilyen rezisztenciát okozó mutáció) alkalmazásával is meg lehet szerkeszteni egy kezdetleges genetikai térképet, ha a markerek viszonylag random helyezkednek el a kromoszómán. A genetikai térképezés feltétele a megfelelően nagy "mutánspark" létrehozása, és olyan donor illetve recipiens törzsek konstruálása, amelyek az izolált új mutációk térképezését lehetővé teszik.

Az E. coli mutációk térképezésére különböző Hfr törzseket (donor) izoláltak és ezekkel végeztek perctérképezést. Kiderült, hogy sok esetben a gének átjutási sorrendje nem egyezett meg. Ugyanazokat a mutációkat alkalmazva a különböző Hfr izolátumokkal végzett kísérletekben más és más volt az átjutási sorrend ( 10-8. ábra ). 

10-8. ábra:    Különböző Hfr törzsek segítségével készült perctérképek.

Igy a génsorrendek látszólag eltérnek, de ha feltételezzük, hogy az egyes Hfr törzsekben az F-faktor más helyről és irányban indíthatja kromoszóma átvitelt a recipiensbe, akkor minden esetben ugyanaz a kör alakú (cirkuláris) kromoszómatérkép szerkeszthető meg. Tehát az E. coli kromoszómája kör alakú. Újabb és újabb mutációk izolálásával és térképhelyzetének meghatározásával a genetikai térképet egyre pontosabbá tették (lásd: Genetikai térképek).

A Hfr törzsek esetében az F-plazmid eleve kromoszómába integrálódott formában van jelen. Ezért sokkal nagyobb a kromoszómatranszfer gyakorisága, és ezért nincs általában donor tulajdonság (fertilitási régió) átjutás.

Az önálló replikonként jelen lévő F-plazmidnál a helyzet éppen fordított. A donor tulajdonság nagy gyakorisággal átjut, mert az oriT és fertilitási régiót nem választja el egy teljes kromoszóma. Ez a Luca Cavalli-Sforza által kapott eredmények magyarázata. A 10-10 ábrán két konjugációban részt vevő E. coli sejt látható.

10-9: Az F-plazmid szerkezete és integrációja A konjugációnál (O) a transzfer kezdőpontja. Nyíl jelzi a transzfer irányát. Látható, hogy integráció esetén legutoljára a fertilitási gének jutnak át. A párosodási régió segítségével a plazmid a kromoszóma több pontjára is beépülhet, így jönnek létre a különböző Hfr törzsek.

10-10: Egy konjugáció elektronmikroszkópos felvétele A konjugációs csatornát arra specifikus (a piluson keresztül fertőző) fágok segítségével tették láthatóvá. A felső a donor, az alsó a recipiens E. coli sejt.

10-11a. ábra: Az F-plazmid tra-trb régiója Az oriT régióban a TraY és TraI fehérjék hasítják az egyik DNS-szálat és 5'-végnél kezdve ez a szál kerül át a recipiensbe (10-11b. ábra)

10-11b. ábra: Az F-plazmid tra-trb régiója Az oriT régióban a TraY és TraI fehérjék hasítják az egyik DNS-szálat és az 5'-végnél kezdve ez a szál kerül át a recipiensbe (10-11b. ábra) Az F-plazmidról ma már tudjuk, hogy nagyjából 100 kb nagyságú. Több mint 30 kb hosszan helyezkedik el rajta a transzfert kódoló géncsoport, amelynek a pilus képzésben és a konjugációban van szerepe (10-11a ábra). Itt található az oriT régió és vagy két tucat tra és trb gén is. A pilusok anyagát adó pilin monomereket a traA gén kódolja. Az ún. "párosodási régió", amely elősegíti a  plazmid integrálódását, inszerciós szekvenciákból (IS, lásd később) származó  elem, amely a kromoszóma számos pontján is megtalálható. Konjugációkor egy egyszálú DNS jut át, amely a recipiens sejtben újra dupla szálú lesz, és egyes részei kettős vagy páros számú homológ rekombinációval kicserélődhetnek a recipiens kromoszóma megfelelő részével (10-12 ábra ). Az átjutási idő mérése (perctérkép) nagy távolságokra lévő markerek térképezését teszi lehetővé, és speciálisan az E. coli Hfr törzsek esetében használható.

10-12: Rekombináció baktériumokban A konjugációval átjutott markerek (gének) beépüléséhez legalább két rekombinációs esemény szükséges. (a) nincs rekombináció (b) egy crossing over van, a termék nem "életképes" (c) két rekombináció esetén az a+ marker kicserélődik az a – markerrel és a+ rekombináns baktérium keletkezik.

10-13: Hfr törzs esetében a késői markerre szelektálva végezhetünk rekombinációs térképezést, ahol az arg és met  markerek távolságát a rekombinánsok számából számíthatjuk ki (a bővebb magyarázatot lásd a szövegben).

Kétpontos térképezés estén két marker egymástól való távolságát mérhetjük meg. Több kétpontos térképezés eredménye alapján meghatározhatjuk több marker egymáshoz viszonyított helyzetét is, ha a kisérletben szereplő markerek nincsenek túl közel egymáshoz.

   Például a 10-13. ábrán látható elrendezésben a leu-arg távolság =5, az arg-met távolság =5 és ha egy harmadik kísérletben a leu-met távolság 10-nek adódik, akkor következtethetünk a fenti leu-arg-met sorrendre.

Hárompontos térképezés esetén egy szelektált és két nem szelektált marker közötti összes lehetséges rekombinációs eseményt együtt tudjuk vizsgálni, egyetlen keresztezésben. Ha a három marker a 10-13. ábrán mutatott sorrendben helyezkedik el, akkor sok leu⁺arg⁺met⁺ rekombináns fog keletkezni és nagyon kevés vagy semennyi leu⁺ arg^- met⁺ variánst találunk (leu⁺ -ra szelektálunk), hiszen ez utóbbi kategória megjelenéséhez négyszeres crossing overnek kell lejátszódnia. A meg nem jelenő, vagy ritka rekombináns kategória egyben megerősíti a markerek sorrendjét is. Ha a sorrend leu - met - arg lenne a valóságban, akkor a leu⁺ arg⁺met^- kategória lenne ritka, és több leu⁺arg ^- met ⁺ változat lenne.